标记原理

在特定的pH范围内，生物素能够特异性地与伯氨基（如N-末端及赖氨酸残基侧链）反应，形成稳定的酰胺键，从而实现与蛋白质的有效偶联。结合生物素-亲和素系统，这种方法已广泛应用于流式细胞术、荧光成像、蛋白质印迹及ELISA检测中，以增强信号强度，提高检测灵敏度。

生物素标记使用量的计算

生物素试剂的使用量取决于待标记蛋白质的数量及浓度。例如，实验数据表明，标记2mg/ml的抗体（如IgG，150KD）时，使用生物素与抗体的分子比为20:1可实现最佳效果。而其他蛋白的标记可以根据此比例进行调整。举例来说，若标记1mg的蛋白（浓度约2mg/mL），则生物素与蛋白（150KD）的分子比为20:1，生物素的摩尔浓度为10mM，因此生物素的用量可依以下步骤计算：首先计算所需的生物素的物质的量n，接着计算所需的生物素的体积V。

操作过程

实验前准备

1. 仔细阅读标记试剂盒的使用说明书。
2. 待标记抗体应不含BSA等其它蛋白，叠氮钠、甘氨酸、Tris或任何含游离氨基的添加物需在操作第一步中去除。
3. 依照生物素标记使用量的计算公式计算所需生物素的量。
4. 提前20分钟将试剂盒从冰箱中取出，使其各组分平衡至室温。
5. 浸润超滤管：向干燥的超滤管滤芯中加入500μL标记缓冲液，室温放置10分钟备用，随后弃去标记缓冲液以保持超滤管滤芯湿润。
6. 溶解生物素：用30μL DMF溶解0.1mg生物素，静置10分钟直至充分溶解，此时生物素浓度为10mM，盖好管子待用。

标记流程

1. 将1mg待标记抗体放入超滤管中，并加入不超过超滤管最大体积的标记缓冲液，12,000g离心3分钟；此步骤可重复3次；最后一次超滤完成后加入0.5mL标记缓冲液，将抗体浓度调整至约2mg/mL。
2. 在超滤管中加入133μL的10mM生物素，并轻轻混匀。将其放入37℃恒温箱中避光孵育30分钟。
3. 以12,000xg离心10分钟。
4. 向超滤管中加入适量的1×PBS，轻轻混匀，12,000g离心3分钟，重复此步骤3次。
5. 收集超滤管中的溶液（即生物素标记的抗体），然后加入0.2mL的1×PBS，轻轻混匀。将超滤管倒置于另一个收集管中，8000×g离心5分钟，收集管中的溶液即为生物素标记的抗体。纯化后的抗体可通过A280或BCA法测定蛋白浓度。
6. 向标记后的抗体中添加保存液，并在-20°C存储。

注意事项

1. 请根据待标记蛋白的分子量选择合适的试剂盒，本试剂盒来自尊龙凯时-人生就是博（货号：RE80002），提供50KD的超滤管。
2. 生物素易受潮水解失效，需密封存放于-20°C或-80°C。为防止水蒸气凝结，实验前应将其平衡至室温。
3. 最好一次性使用溶解后的生物素，如果剩余可密封存放于-20°C冰箱内，一个月内可使用，但标记效率可能下降。
4. 本试剂盒可用于标记其它含有游离氨基的蛋白，具体标记比例依据待标记物中的可用氨基数量决定。
5. 推荐的生物素与蛋白（150KD）的最佳分子比为20:1，以确保生物素顺利标记蛋白，最佳比例可能因蛋白材质不同而有所变化，用户可根据实际情况进行优化。

产品特点

• 快速：整个标记过程最快仅需90分钟。
• 方便：本生物素标记试剂盒提供了生物素标记所需的全部试剂；生物素已活化可直接使用；通过超滤管离心脱盐及去除游离的生物素，无需透析等繁琐操作。
• 使用灵活：可用于微量标记亦可大量标记，每支超滤管每次可标记0.1-1mg蛋白。
• 脂溶性：本试剂盒中的生物素为脂溶性，适合用于需将生物素标记的蛋白引入细胞膜内进行反应的实验，标记方式相对有效。